細(xì)胞凍存步驟

1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，200-074-400凍存袋供應(yīng)商，加入適量PBS洗1-2遍;

2.加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中消化;

3.待消化到位后加入適量血漿或完全培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;

4.配制凍存液，待細(xì)胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，轉(zhuǎn)移到凍存管中;

5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

6.凍存細(xì)胞后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，

為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，再繼續(xù)凍存

凍存袋的背景知識(shí)

采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以的保存細(xì)胞活力。如今細(xì)胞凍存多采用甘油或二亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，CS250凍存袋供應(yīng)商，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

凍存袋方法的改進(jìn)

自1977年以來，我們應(yīng)用四級(jí)梯度降溫凍存法對(duì)30余株哺乳動(dòng)物細(xì)胞及2株節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞共1000多支安瓶進(jìn)行了冷凍保存，200-074-401凍存袋供應(yīng)商，效果較好，大部分細(xì)胞的活存率在70%以上。在此基礎(chǔ)上對(duì)8株抗登革4型(DEN一4)病毒雜交瘤細(xì)胞400多支安靚進(jìn)行了凍存。鑒于四級(jí)降溫凍存法步驟多，需要經(jīng)過4℃冰箱和一20℃冰箱長達(dá)7~8小時(shí)的梯度降溫，凍存袋供應(yīng)商，較難適應(yīng)單工作中細(xì)胞凍存的需要。因此，自1982年以來我們摸索了影響細(xì)胞凍存的主要因素，確定了雜交瘤細(xì)胞凍存的適保護(hù)劑濃度(1.2〕，并研制成功細(xì)胞凍存簡易裝置。