小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)
成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞，僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細(xì)胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞，再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細(xì)胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細(xì)胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細(xì)胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細(xì)胞占12.37±3.34%，CD90.2陽性細(xì)胞占56.98±4.51%，二者都陽性細(xì)胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細(xì)胞和二者都陽性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，CD90.2陽性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包費(fèi)用，percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度
選擇實(shí)驗(yàn)外包公司需要注意哪些事項(xiàng)？
1. 實(shí)地考察
可以到公司實(shí)地考察一下實(shí)驗(yàn)室，看一下實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、設(shè)備儀器情況，是否能滿足實(shí)驗(yàn)方案所需條件。能整體承接課題，動(dòng)物細(xì)胞。一些大型儀器公司不一定有，看有沒有高校平臺(tái)資源渠道共享。確保是真實(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的，這樣后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)也比較可靠。
2. 方案評(píng)估
實(shí)驗(yàn)合作前期一般會(huì)進(jìn)行所需實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的評(píng)估，來確定終實(shí)際實(shí)驗(yàn)方案和報(bào)價(jià)。方案評(píng)估可以看出外包團(tuán)隊(duì)的性。一個(gè)可靠的外包公司會(huì)對(duì)方案提出針對(duì)性的建議，評(píng)估各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)是否能做，以及根據(jù)預(yù)算情況和實(shí)際操作對(duì)細(xì)節(jié)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。任何實(shí)驗(yàn)都是有不確定性的，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家，但是前期敲定好方案能為后續(xù)實(shí)際開展實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)，也會(huì)省去許多隱患和麻煩。
透射電鏡觀察:可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊.集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和調(diào)亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
結(jié)果評(píng)判:調(diào)亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。調(diào)亡I期( pro-apoptosis nuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象( c***itati)的空泡結(jié)構(gòu); IIa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生調(diào)亡小體。
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