大鼠脂肪的分離
將***切取的大鼠脂肪***盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。
經(jīng)***切除獲得的大鼠皮下脂肪***消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細胞都附著于這層膜上，通過術獲取的人脂肪***消化后則無此現(xiàn)象。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結締***未被完全消化，細胞，穿過細胞篩進入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結構，流式細胞技術，但不會損傷其他蛋白質。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細胞篩過濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗，每毫升***切除的大鼠脂肪可分離基質血管成分細胞約1.81×106個。原代培養(yǎng)2.24×10^7個大鼠基質血管成分細胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細胞，細胞剩余率27%。
細胞實驗介紹——流式細胞術檢測細胞周期和凋亡
流式細胞術檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（G0期），動物細胞培養(yǎng)，而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細胞開始RNA和蛋白質的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細胞核內DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當DNA成為4倍體時，細胞進入G2期。G2期細胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質，細胞遷移實驗，直到進入M期。
PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結合，其結合的量與DNA的含量成正比例關系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。
一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細胞儀檢測。
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細胞內膜翻轉至細胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的PS相結合。利用這一原理，可以將AnnexinV標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。PI的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。
一般流程：細胞收集-PI-AnnexinV標記-流式細胞儀檢測。
結果示例：
圖 A 細胞周期檢測圖；B 細胞凋亡檢測圖
小鼠成骨細胞和破骨細胞共培養(yǎng)模型的建立
細胞之間的相互調控作用奠定基礎.方法利用24 h內新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細胞的培養(yǎng)皿中進行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時間后進行破 骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一 步采用RT- PCR對破骨細胞標志酶***基質金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和***蛋白酶K (Cathepsin K )的表達進行檢測結果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP(+)多核細胞形成13天TRAP(+ )多核細胞數(shù)目達到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，陷窩面積呈增加趨勢;破骨細胞標志***TRAP在共培養(yǎng)3天時開始表達，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達結論共培養(yǎng)體系中成骨細胞對破骨細胞調控作用顯著誘導的破骨細胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細胞和破骨細胞之間的相互調控作用研究.
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